Menu
我公司是结合网络技术为家电维修行业服务最早,维修技术最专业的家电维修公司。公司总部设立在北京,各个省份均有我们的维修网点,从事20多年家电行业,值得您的信赖!

当前位置主页 > 糖类 >

实习一糖类的颜色响应

日期:2019-11-07 14:34 来源: 糖类

  第十六章 一、实验目的 实验技术 实验一 糖类的颜色反应 1.了解糖类某些颜色反应的原理。 2.学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、实验原理 1.α-萘酚反应(Molisch 反应)原理 糖在浓无机酸(硫酸、盐酸)作用下,脱水生成糠醛及糠醛衍生物,后者能与 α-萘酚 生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性,故此反应不是糖类的特异反 应。 2.间苯二酚反应(Seliwanoff 反应)原理 在酸作用下,酮糖脱水生成羟甲基糠醛,后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反 应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢,只有在糖浓度较高或煮沸时间较 长时,才呈微弱的阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。 三、器材 1.试管及试管架 3.水浴锅 四、试剂 1.莫氏(Molisch)试剂: 5% α-萘酚的酒精溶液,称取 α-萘酚 5g,溶于 95%酒精中, 并用此酒精使总体积达 100mL,贮于棕色瓶内。此试剂需新鲜配制。 2.塞氏(Seliwanoff)试剂:称取间苯二酚 0.05g 溶于 30 mL 浓盐酸中,再用蒸馏水稀 释至 100 mL,此试剂需新鲜配制。 3.1%葡萄糖溶液:称取葡萄糖 1g,溶于 100mL 蒸馏水中。 4.1%果糖溶液:称取果糖 1g,溶于 100mL 蒸馏水中。 5.1%蔗糖溶液:称取蔗糖 1g,溶于 100mL 蒸馏水中。 6.1%淀粉溶液:称取可溶性淀粉 1g 与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物,然后缓缓倾入 沸蒸馏水中,边加边搅,最后以沸蒸馏水稀释至 100mL。 7.0.1%糠醛溶液:称取糠醛 0.1g,溶于 100mL 蒸馏水中。 8.浓硫酸 500mL 五、操作 1.α-萘酚反应(Molisch 反应) 取 5 支试管,分别加入 1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、 0.1%糠醛溶液各 1.5mL。再向 5 支试管中各加入 2 滴莫氏试剂,充分混合。斜执试管,沿 2.滴管 管壁慢慢加入浓硫酸约 1mL,慢慢立起试管,切勿摇动。浓硫酸在试液下形成两层。在二 液分界处有紫红色环出现。观察、记录各管颜色。 试剂 1%葡萄糖溶液 1%果糖溶液 1%蔗糖溶液 1%淀粉溶液 0.1%糠醛溶液 2.间苯二酚反应(Seliwanoff 反应) 取 3 支试管,分别加入 1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液各 5mL。再向各管 分别加入塞氏试剂 2mL,混匀。将 3 支试管同时放入沸水浴中,注意观察、记录各管颜色 的变化及变化时间。 六、思考题 1.可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在? 2.α-萘酚反应的原理是什么? 现象 解释现象 实验二 一、实验目的 糖类的还原作用 学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。 二、实验原理 许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基, 故在碱性溶液中能将铜、 铋、 汞、铁、银等金属离子还原,同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被 利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。 本实验进行糖类的还原作用所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是含 Cu 的碱性溶液,能使还原糖氧化而本身被还原成红色或黄色的 Cu2O 沉淀。生成 Cu2O 沉 淀的颜色之所以不同是由于在不同条件下产生的沉淀颗粒大小不同引起的,颗粒越小呈黄 色,越大则呈红色。如有保护性胶体存在时,常生成黄色沉淀。 三、器材 1.试管及试管架 2.竹试管夹 3.水浴锅 4.电炉 四、试剂 1.斐林(Fehling)试剂 菲林甲液(硫酸酮溶液) :称取 34.5g 硫酸铜(CuSO4· 5H2O)溶于 500mL 蒸馏水中。 菲林乙液(碱性酒石酸盐溶液) :称取 125g 氢氧化钠和 137g 洒石酸钾钠溶于 500 mL 蒸馏水中。 为了避免变质,甲、乙二液分开保存。用前,将甲、乙二液等量混合即可。 2.本尼迪克特(Benedict)试剂 2+ 称取柠檬酸钠 173g 及碳酸钠(Na2CO3· H2O)100 g 加入 600mL 蒸馏水中,加热使其 溶解,冷却,稀释至 850mL。 另称取 17.3g 硫酸铜溶解于 100 mL 热蒸馏水中,冷却,稀释至 150mL。 最后,将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中,边加边搅拌,混匀,如有 沉淀,过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。 3.1%葡萄糖溶液:称取葡萄糖 1g,溶于 100mL 蒸馏水中。 4.1%果糖溶液:称取果糖 1g,溶于 100mL 蒸馏水中。 5.1%蔗糖溶液:称取蔗糖 1g,溶于 100mL 蒸馏水中。 6.1%麦芽糖溶液:称取麦芽糖 1g,溶于 100mL 蒸馏水中。 7.1%淀粉溶液:称取可溶性淀粉 1g 与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物,然后缓缓倾 入沸蒸馏水中,边加边搅,最后以沸蒸馏水稀释至 100mL。 五、操作 先取 1 支试管加入斐林试剂约 1mL,再加入 4 mL 蒸馏水,加热煮沸,如有沉淀生 成,说明此试剂已不能使用。经检验,试剂合格后,再进行下述实验。 取 5 支试管, 分别加入菲林甲、 乙液各 1 mL, 再向各试管分别加入 1%葡萄糖溶液、 1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%麦芽糖溶液、1%淀粉溶液各 1mL。置沸水浴中加热数分 钟,取出,冷却。观察各管溶液的变化。 另取 6 支试管,用本尼迪克特试剂(每管加 2mL)重复上述实验。 比较两种方法的结果。 斐林氏与本尼迪克特试法: 现象 试剂 斐林氏试剂 本尼迪克试剂 试解释以上表格现象: 六、思考题 1.斐林氏、本尼迪克特试剂法检验糖的原理是什么? 2.你熟悉的糖中那些具有还原性? 溶液 液 1% 葡萄糖溶 1% 果糖溶液 1% 蔗糖溶液 1% 麦芽糖溶 液 1% 淀粉溶液 实验三 一、实验目的 熟悉一些常见蛋白质的颜色反应 二、实验原理 蛋白质的颜色反应 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用,可产生特定的颜色反应,不同蛋白质所含氨 基酸不完全相同,颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应,一些非蛋白物质亦 可产生相同颜色反应,因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反 应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。重要的颜色反应有: 1.双缩脲反应 将尿素加热到 180℃,则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲,并放出一分子氨。双缩 脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物,此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中 含有许多和双缩脲结构相似的肽键,因此也能起双缩脲反应,形成红紫色络合物。通常可 用此反应来定性鉴定蛋白质,也可根据反应产生的颜色在 540nm 处比色,定量测定蛋白 质。 2.蛋白质的黄色反应 黄色反应是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反 应。蛋白质溶液遇硝酸后,先产生白色沉淀,加热则白色沉淀变成黄色,再加碱颜色加深 呈橙黄色,这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化,产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮 肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。 3.米伦氏反应 米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物,蛋白质溶液加入米伦试剂后 即产生白色沉淀,加热后沉淀变成红色。酚类化合物有此反应,酪氨酸含有酚基,故酪氨 酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。 4.茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热,则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为 一切氨基酸及 α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应 三、器材 试管和试管架、滴管、水浴锅、酒精灯或电炉、量筒、滤纸片、烘箱、白明胶。 四、试剂 1. 卵清蛋白液:将鸡(鸭)蛋白用蒸馏水稀释 20~40 倍,2~3 层纱布过滤,滤液冷藏 备用。 2. 0.5%苯酚溶液:苯酚 0.5mL,加蒸馏水稀释至 100mL。 3. 1%白明胶液:1g 白明胶溶于少量热水,完全溶解后,稀释至 100mL。 4. 米伦(Millon)试剂:40g 汞溶于 60mL 浓硝酸(比重 1.42),水浴加温助溶,溶解后加 2 倍体积蒸馏水,混匀,静置澄清,取上清液备用。此试剂可长期保存。 5. 0.1%茚三酮溶液:0.1g 茚三酮溶于 95%乙醇并稀释至 100mL。 6.浓硝酸:比重 1.42。 7. 1%硫酸铜溶液:硫酸铜 1g 溶于蒸馏水中,稀释至 100mL。 8. 尿素:如颗粒较粗,最好研磨成粉末状。 9. 10%氢氧化钠溶液:氢氧化难 10g 溶于蒸馏水,稀释至 100mL。 五、操作方法 1.双缩脲反应 ①取少许结晶尿素放在干燥试管中,微火加热,尿素溶化并形成双缩脲,释出的氨可 用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现,停止加热,冷却。然后加 10%NaOH 溶 液 1mL 混匀,观察有无紫色出现。 ②另取一试管,加蛋白质溶液 10 滴,再加 10% NaOH 溶液 10 滴及 1%CuSO4 溶液 4 滴,混匀,观察是否出现紫玫瑰色。 注意事项:硫酸铜不能多加,否则将产生蓝色的 Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐 与铜盐作用生成深蓝色的络离子 Cu(NH3)42+,妨碍此颜色反应的观察。 2.蛋白质的黄色反应 在一试管内,加蛋白质溶液 10 滴及浓硝酸 3~4 滴,加热,冷却后再加 10%NaOH 溶 液 5 滴,观察颜色反应。 3.米伦氏反应 ① 用苯酚做实验:取 0.5%苯酚溶液 1mL 于试管中,加米伦试剂约 0.5mL(米伦试剂 含有硝酸,如加入量过多,能使蛋白质呈黄色,加入量不超过试液体积的 1/5~1/4),小心 加热,溶液即出现玫瑰红色。 ② 用蛋白质溶液做实验:取 2mL 蛋白质溶液,加 0.5mL 米伦试剂,此时出现蛋白质 的沉淀(因试剂含汞盐及硝酸之故),小心加热,凝固之蛋白质出现红色。 注意事项:蛋白质溶液中如含有大量无机盐,可与汞产生沉淀从而丧失试剂的作用, 如此试剂不能测定尿中的蛋白质。另外试液中还不能含有 H2O2、醇或碱,因它们能使试剂 中的汞变成氧化汞沉淀。遇碱必须先中和,但不能用盐酸中和。 4.茚三酮反应 取 1mL 蛋白质溶液置于试管中,加 2 滴茚三酮试剂,加热至沸,即有蓝紫色出现(注 意:此反应必须在 pH5~7 进行)。 六、思考题 1. 氨基酸与蛋白质具有哪些共同的颜色反应?说明原因。 2. 蛋白质除了可以实验中的这些颜色反应外,你还知道哪些蛋白质的颜色反应? 实验四 一、实验目的 蛋白质的沉淀反应 加深对蛋白质的沉淀反应的认识,理解蛋白质沉淀反应的原理。 二、实验原理 蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体,这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性 基团,如—NH3+,—COO-,—SH,—CONH2 等,和水有高度亲和性,当蛋白质与水相遇 时,就很容易被蛋白质吸住,在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在 使蛋白颗粒相互隔开,颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而 不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因,是因为蛋白质颗粒在非等电状 态时带有相同电荷,使蛋白质颗粒之间相互排斥,保持一定距离,不致相互凝集沉淀。 蛋白质由于带有电荷和水膜,因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素 破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷, 则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀: 1. 加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜,同时又中和 了蛋白质分子的电荷, 因此使蛋白质产生沉淀, 这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。 盐析法是分离制备蛋白质的常用方法,不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同,因此调节盐 浓度,可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出,这种方法叫做分段盐析。但中性盐 并不破坏蛋白质的分子结构和性质,因此,若除去或降低盐的浓度,蛋白质就会重新溶解。 2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀,这是由于这些有机溶剂和水有较 强的作用,破坏了蛋白质分子周围的水膜,因此发生沉淀作用。若及时将蛋白质沉淀与丙 酮或乙醇分离,蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。 3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。这是因为蛋白质在碱性溶液中 带负离子,可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。 4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉 淀。 用盐析法或低温下加入丙酮、乙醇使蛋白质沉淀,以及利用等电点的沉淀反应时,虽 然蛋白质已经沉淀析出,然而其分子内部结构并没发生明显的改变,仍保持原有的生物活 性。如除去沉淀因素,蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。因此,这种沉淀作用称为可逆 沉淀作用。但如在温度较高情况下加入有机溶剂来沉淀分离蛋白质或已用有机溶剂沉淀分 离得到的蛋白质没有及时与有机溶剂分开, 都会引起蛋白质的性质发生改变, 这应该注意。 三、器材 试管及试管架、吸管、抽滤瓶、量筒、布氏漏斗。 四、试剂 1. 蛋白质氯化钠溶液取 20mL 蛋清,加蒸馏水 200mL 和饱和氯化钠溶液 100mL,充 分搅匀后纱布滤去不溶物(加氯化钠的目的是溶解球蛋白)。 2. 蛋白质溶液 取 5mL 蛋清,用蒸馏水稀释至 100mL,搅拌均匀后,用纱布过滤。 3. 饱和硫酸铵溶液: 称硫酸铵 850g 加于 1000mL 蒸馏水中, 在 70~80℃下搅拌促溶, 室温中放置过夜,瓶底析出白色结晶,上清液即为饱和硫酸铵溶液。 4. 饱和苦味酸溶液: 取 2g 苦味酸放入三角烧瓶, 加蒸馏水 100mL, 80℃水浴约 10min 使之完全溶解,于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶,上清液即为饱和苦味酸,此液可存放 数年。 5. 1%醋酸溶液、1%醋酸铅溶液、1%硫酸铜溶液、1%三氯乙酸溶液。 6. 0.5%磺基水杨酸溶液。 7. 5%鞣酸溶液。 8. 硫酸铵粉末。 五、操作 1.盐析作用: 取 1 支试管加入 3mL 蛋白质氯化钠溶液和 3mL 饱和硫酸铵溶液, 混匀, 静置约 10min,球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末,边加边用玻璃棒搅 拌,直至粉末不再溶解达到饱和为止,析出的沉淀为清蛋白,再加水稀释,观察沉淀是否 溶解。 2.乙醇沉淀蛋白质:取 1 支试管架蛋白质溶液 1mL,加晶体氯化钠少许(加速沉淀并使 沉淀完全)待溶解后再加入 95%乙醇 2mL 混匀。观察有无沉淀析出。 3.有机酸沉淀蛋白质:取 2 支试管,各加入蛋白质溶液约 0.5mL,然后分别滴加 10% 三氯乙酸和 0.5%磺基水杨酸数滴。观察蛋白质沉淀。 4.重金属盐沉淀蛋白质取: 2 支试管各加蛋白质溶液 2mL, 一管内滴加 1%醋酸铅溶液, 另一管内滴加 1%硫酸铜溶液,观察沉淀生成。 5.生物碱试剂沉淀蛋白质取:2 支试管,各加蛋白溶液 2mL 及 1%醋酸 4~5 滴。其中 一管滴加 5%鞣酸,另一管滴加饱和的苦味酸溶液,观察沉淀的形成。 六、思考题 1.蛋白质的中性盐沉淀和重金属沉淀有何差别?各有什么用途? 2.为什么鸡蛋清可作为铅或汞中毒的解毒剂? 实验五 一、实验目的 蛋白质等电点测定 掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。 了解等电点的意义及其与分子聚沉能力的关系。 二、实验原理 蛋白质同氨基酸一样,是两性电解质,在不同的 pH 水溶液中解离后所带正、负电荷 不同。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时,蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相 等,以兼性离子状态出现,在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动,也不向阳极移动,这 时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。 各种蛋白质具有特定的等电点,这时和它所含的氨基酸的种类和数量有关。如蛋白质 分子中含碱性氨基酸较多,其等电点偏碱。例如从雄性鱼类成熟精子中提取的鱼精蛋白含 精氨酸特多,其等电点为 12.0~12.4。如蛋白质分子中含酸性氨基酸较多,则其等电点偏 酸。例如胃蛋白酶含酸性氨基酸残基为 37 个,而碱性氨基酸残基仅含 6 个,其等电点为 1.0 左右。含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质,其等电点大多为中性偏酸,约 5.0 左右。 蛋白质等电点多接近于 pH7.0,略偏酸性的等电点也较多。处于等电点的蛋白质表现 电中性,所以在溶液中的稳定性很低,容易沉淀析出。将酪蛋白溶液分置于连续不同的 pH 环境中,通过观察混浊程度可测得酪蛋白的等电点。 三、器材 试管和试管架、滴管、吸管(1 和 5mL)、容量瓶。 四、试剂 1. 酪蛋白醋酸钠溶液:称取纯酪蛋白 0.25g,加蒸馏水 20mL 及 1.00mol/L 氢氧化钠 溶液 5mL(必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加 1.00mol/L 醋酸 5mL(必须准确),倒入 50mL 容量瓶内,用蒸馏水稀释至刻度,混匀,结果酪蛋白溶于 0.10mol/L 醋酸钠溶液内, 其浓度为 0.5%。 2. 0.01mol/L 醋酸溶液 3. 1.00mol/L 醋酸溶液 4. 0.10mol/L 醋酸溶液 5. 1.00mol/L 氢氧化钠溶液(氢氧化钠和醋酸的浓度要标定) 五、操作 1.取 9 支粗细相近的干燥试管,编好号后按表 5-1 的顺序准确地加入各种试剂。 2.加完后观察上述各管的混浊程度,静置约 20min,再视其沉淀情况,以-,+,++, +++,++++符号表示沉淀的多少。根据观察的结果,指出哪一个 pH 是酪蛋白的等电点(混 浊显著或静置后沉淀最多,上部溶液变得最清亮一管的 pH 值,即为酪蛋白的等电点)。 3. 该试管要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外, 实验中应该严格按照定量分析的操作进行。 为了保证实验的重复性或为了进行大批 量的测 定,可以事先按照上述的比例配制成大量的 9 种不同浓度的醋酸溶液。实验时分别准确吸 取 4mL 该溶液,再各加入 1mL 酪蛋白醋酸钠溶液。 表 5-1 试剂加入及数据记录表 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 酪蛋白醋 酸钠溶液 (毫升) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 水 (毫升) 8.38 7.75 8.75 8.50 8.00 7.00 5.00 1.00 7.40 0.01mol/L 醋酸 (毫升) 0.62 1.25  ̄  ̄  ̄  ̄  ̄  ̄  ̄ 0.10mol/L 醋酸 (毫升)  ̄  ̄ 0.25 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00  ̄ 1.00mol/L 醋酸 (毫升)  ̄  ̄  ̄  ̄  ̄  ̄  ̄  ̄ 1.60 5.9 5.6 5.3 5.0 4.7 4.4 4.1 3.8 3.5 pH 观察沉淀出现情况 0 分钟 10 分钟 20 分钟 六、思考题 1.该方法测定蛋白质等电点的原理是什么? 2.蛋白质等电点在实际生产上有何意义? 实验六 一、实验目的 1、了解等电点沉淀法 酪蛋白的制备——等电点沉淀法 2、学习从牛奶中制备酪蛋白的方法 3、加深对蛋白质等电点性质的理解 二、实验原理 蛋白质是一种亲水胶体,在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外,蛋白质 又是一种两性离子,在一定 pH 溶液能够维持一个稳定的状态。但是调节蛋白质溶液的 pH 值至等电点时,蛋白质会因失去电荷而变得不稳定,此时若再加脱水剂或加热,水化层被 破坏,蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时 溶解度最低的原理,而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物, 等电点为 4.7。将牛乳的 pH 调至 4.7 时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀,除去脂类 杂质后便可得到较纯的酪蛋白。 但单独利用等电点沉淀法来分离生化产品效果并不太理想,因为即使在等电点时,有 些两性物质仍有一定的溶解度,并不是所有的蛋白质在等电点时都能沉淀下来,特别是同 一类两性物质的等电点十分接近时。生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法并用,这样沉淀 的效果较好。 三、器材 离心机、抽滤装置(布氏漏斗) 、电炉、温度计、天平、表面皿、烧杯、容量瓶、移液 管、酸度计。 四、试剂 (1)鲜牛奶; (2)0.5mol/L HCl; (3)0.5 mol/L NaOH; (4)95%乙醇; (5)无水之 醚; (6)0.2mol/LpH4.7 醋酸-醋酸钠缓冲液,先配制 A 液与 B 液。 (A 液:0.2 mol/L 醋酸 钠溶液:称 NaAC· 3H2O 54.44g,定容至 2 000 mL。B 液:0.2 mol/L 醋酸溶液。称取优级 纯醋酸(含量大于 99.8%)12g 定容至 1 000 mL。取 A 液 1 770 mL,B 液 1 230mL 混合即 得 pH4.7 的醋酸钠-醋酸缓冲液 3 000 mL。 ) ; (7)乙醇-混合液。乙醇:=1:1 (V/V) 。 五、操作 1.将 50mL 牛奶加热到 40℃。在搅拌下慢慢加入预热到 40℃的 pH4.7 的醋酸缓冲液 50mL。用精密 pH 试纸或酸度计调 pH 至 4.7。将上述悬浮液冷至室温。离心 15 min(2000 r/min),弃去清液,得酪蛋白粗制品。 2.用水洗沉淀,离心 10 min(3000 r/min),弃去上清液;如此操作三次。 3.在沉淀中加入 30mL 乙醇。搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙 醇-混合液洗沉淀两次。最后用洗沉淀两次,抽干。 4.将沉淀摊开在表面皿上,风干得酪蛋白纯品。 5.准确称重,计算含量和得率。 含量:酪蛋白 g/100mL 牛乳。 式中理论含量为 3.5g/100mL 牛乳。 六、思考题 1.为什么调整溶液的 pH 值可将酪蛋白沉淀出来? 2.你还可以采用哪些其他的方法来制备酪蛋白? 3.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么? 实验七 一、实验目的 氨基酸的纸层析 1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 2.学习纸层析法的操作技术,分析未知样品氨基酸的成分。 二、实验原理 用滤纸为支持物进行层析的方法,称为纸层析法,它是分配层析法的一种。纸层析所 用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的—OH 基的亲水性基团,可吸 附有机溶剂中的水作为固定相,有机溶剂作为流动相,它沿滤纸自下向上移动,称为上行 层析;反之,使有机溶剂自上而下移动,称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层,样 品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配,由于它们各自的分配系数不同,故在流动相 中移动速率不等,从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。纸层析法主要是依据混合组分对 二相分配系数的差异进行分离,但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。氨基酸 经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点,氨基酸在滤纸上的移动速率用 Rf 表示。 Rf = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变,Rf 值是常数,因 此可做定性分析参考。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层 析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。由于氨基酸无色,可利用茚三酮反 应使氨基酸层析点显色,从而定性和定量。 三、器材 1.层析缸 2.毛细管 3.喷雾器 4.培养皿 5.层析滤纸(新华一号) 6.小烧杯(50mL) 7.铅笔 8.直尺 四、试剂 1.展层剂:正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(V/V),摇匀后放置半天以上,取上清液 备用。 2.氨基酸溶液(用 0.01mol/L 的盐酸配制) :0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨 酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为 0.5%) 。 3.显色剂:0.1%水合茚三铜正丁醇容液。 五、操作 1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2.取层析滤纸(长 22cm、宽 15cm)一张。在纸的一端距边缘 2~3cm 处用铅笔划一 条直线cm 作一记号如下图。 3.点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这 6 个位置上,干后再点一次。每点在纸 上扩散的直径最大不超过 3mm。 4.扩展 用线将滤纸缝成筒状,纸的两边不能接触。将盛有约 20 mL 扩展剂的培养皿 迅速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面需 低于点样线cm) 。待溶剂上升 15~20 cm 时即取出滤纸,用铅笔描出溶剂前沿界线,自 然干燥或用吹风机热风吹干。 5.显色 用喷雾器均匀喷上 0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后置 80℃烘箱中烘烤 3~5 分 钟或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6.计算各种氨基酸的 Rf 值。 六、思考题 1.何谓纸层析法? 2.何谓 Rf 值?影响 Rf 值的主要因素是什么? 3.怎样制备展层剂? 4.层析缸中平衡溶剂的作用是什么? 实验八 一、实验目的 电泳技术——纸电泳分离氨基酸 1.了解电泳技术的基本原理; 2.掌握纸上电泳的原理和操作技术。 二、实验原理 带电颗粒在电场的作用下, 向着与其电性相反的电极移动, 称为电泳 (electrophoresis) 。 电泳现象早在 1808 年就被发现,但是作为一项生物化学研究的方法学,却是在 1937 年 Tiselius 在电泳仪器方面取得重大成就后, 才得到较大的进展。 特别是后来应用滤纸作为支 持物,形成了设备简单,操作方便的纸上电泳法后,电泳技术在生物化学和其他领域研究 中得到了广泛的应用和发展。近年来,由于采用多种新型支持物,仪器装置亦得到不断改 进,因此出现了许多新型的电泳技术。 目前所采用的电泳方法,大致可分为三类:显微电泳,自由界面电泳和区带电泳。区 带电泳应用比较广泛,按其支持物物理性状的不同可分成 4 大类: 1.滤纸及其他纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维)薄膜电泳。 2.凝胶电泳:如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。 3.粉末电泳:如纤维素粉、淀粉、玻璃分电泳。 4.线丝电泳:如尼龙丝,人造丝电泳。此为微量电泳方法。 区带电泳现已广泛应用于生物化学物质的分析分离以及临床检验等方面。现以纸上电 泳为例介绍有关电泳的原理和操作技术。 任一物质质点,由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其他带电质点,在电场中 便会向一定的电极移动。例如氨基酸、蛋白质分子等,由于它具有许多可解离的酸性基团 和碱性基团,如-COO 和-NH3+等,它是一典型的两性电解质,在一定的 pH 条件下,就会 - 解离而带电,带电的性质和多少决定于蛋白质分子的性质及溶液的 pH 值和离子强度。在 某一 pH 条件下,蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数,即净电荷等于零。此时 蛋白质质点在电场中不移动,溶液的这—pH 值,称为该蛋白质的等电点(pI)。如果溶液的 pH 小于 pI,则蛋白质分子结合一部分 H,而带正电荷,在电场中就会向负极移动。反之, 溶液的 pH 大于 pI,则蛋白质分子会解离出—部分 H 而带有负电,此时蛋白质分子在电场 中就会向正极移动。 不同的带电颗粒在同—电场中泳动速度不同,常用迁移率(或称泳动度,mobility)来表 示。迁移率的定义是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 m ?v/E ? d /t ? dl / tV V /l 式中:m 为迁移率(cm2/V· s);v 为颗粒的泳动速度(cm/s);E 为电场强度(V/cm);d 为 颗粒泳动的距离(cm);l 为滤纸的有效长度(cm),即滤纸与两极溶液交界面间的距离;V 为 实际电压(V);t 为通电时间秒(s)。 通过测量 d,l,v,t 便可计算出颗粒的迁移率。 带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量,颗粒的大小和形状有关。一般 说,所带净电荷量愈多,颗粒愈小,愈接近球形,则在电场中的泳动速度愈快,反之则愈 慢。泳动速度除受颗粒本身性质的影响外,还和其他外界因素有关。 现将影响颗粒泳动速度的外界因素讨论如下: 1、电场强度:电场强度是指每 lcm 的电位降,也称电位梯度(电势梯度)。电场强度对 泳动速度起着决定性作用。电场强度愈高,则带电颗粒泳动愈快。例如进行纸上电泳时, 滤纸两端相距 20cm 处测得电位降为 200V,则电场强度为 200/20=10V/cm。 纸上电泳根据电场强度的大小可分为常压(100~500V)纸上电泳和高压(2 000~10 000V)纸上电泳,前者电场强度一般为 2~10V/cm,分离时间较长,从数小时到数天。后 者电场强度为 50~200V/cm,电泳时间很短;有时仅需数分钟。常压纸上电泳多用于分离 蛋白质等大分子物质,高压纸上电泳则多用来分离氨基酸,多肽、核苷酸、糖类等小分子 物质。 2、溶液的 pH 值;溶液的 pH 值决定带电颗粒解离的程度,亦即决定其所带净电荷的 多少。对蛋白质两性电解质而言,pH 值离等电点越远,则颗粒所带净电荷越多,泳动速度 也越快,反之,则越慢。因此当分离某一蛋白质混合物时,应选择一个合适的 pH,使各种 蛋白质所带的电荷量差异较大,有利于彼此分开。为了使电泳过程中溶液 pH 值恒定,必 须采用缓冲溶液。 3、溶液的离子强度:离子强度影响颗粒的电动电势(ξ),溶液的离子强度越高,电动 电势越小,则泳动速度越慢;反之,则越快。一般最适的离子强度在 0.02~0.2 之间。溶液 离子强度的计算方法如下: I ? ?CZ 2 / 2 式中:I 为溶液的离子强度;C 为离子的摩尔浓度;Z 为离子的价数。 4、电渗:在电场中,由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电,在电场 作用下,溶液就向一定方向移动,称为电渗现象。在纸上电泳中,由于纸上吸附 OH-离子 带负电荷,而与纸相接触的水溶液带正电荷,液体便向负极移动,移动时可携带颗粒同时 移动。所以电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的泳动速度与由于电渗影响而被携带的 移动速度两者的加和。若是颗粒原来向负极移动,则其表观速度将比泳动速度快,若原来 向正极移动,则其表观速度将比泳动速度慢。 为了校正这一误差, 可用一中性物质如糊精, 蔗糖或葡聚糖等与样品平行作纸上电泳, 然后将其移动距离自实验结果中除去。 5、滤纸的选择:要求纸质均匀和吸附力小,否则电场强度不均匀,使结果不能重复, 并得不到好的图谱。如果吸附力大,则蛋白质或其他胶体在它们泳动的过程中有一部分被 纸所吸附,以致于泳动快的部分其相对含量降低。因此常将滤纸事先处理,以减低滤纸的 吸附能力,使达到更好的分离效果。若选用国产新华滤纸,或 WhatmanNo.1 号滤纸,一般 不必再进行预处理。 6、其他因素:例如缓冲溶液的粘度。缓冲溶液与带电颗粒的相互作用以及电泳时温度 的变化等因素,也都影响泳动速度。 本实验以混合氨基酸为材料,用纸上电泳法分离其中的不同氨基酸。 三、器材 水平式电泳槽、 电泳仪、 吹风机、 点样器、 喷雾器、 铅笔、 杭州新华滤纸或 WhatmanNo.1 号滤纸 四、试剂 1、1/15mol/L 磷酸盐缓冲液(离子强度 0.08,pH6.0) 配制方法: 甲液:1/15mol/L Na2HPO4 溶液(Na2HPO4 9.465g;蒸馏水加至 1000mL) 乙液:l/15mol/L KH2PO4 溶液 (KH2PO4 9.07g;蒸馏水加至 1000mL) 分装在棕色瓶内,于 4℃冰箱中保存,用时甲、乙两液各按 1︰9 比例混合,即可得所 需 pH 的缓冲液。 2、1%丙氨酸、1%谷氨酸、1%赖氨酸标准溶液。 吸取上述氨基酸标准溶液各 10mL 于 50mL 烧杯中配成混合样品。 3、显色液(0.5%茚三酮丙酮溶液) 五、操作 1、仪器及样品的准备 将电泳槽洗净,晾干、放平。然后量取约 700~800mL 缓冲液先倒入电泳槽,使两端 液面达到平衡。 2、滤纸的剪裁 用刀片将新华滤纸或 WhatmanNo.1 号滤纸,裁成长 21.5cm,宽 13.8cm 的滤纸条,并 按以下规格用铅笔作上正负记号。 剪裁前要选择纸质比较均匀的纸,用刀片裁整齐,注意纸边不能有缺刻或起毛,可先 用废纸条练习,然后再正式裁剪。 3、点样 1) 原点的位置和形状: 对于一个未知样品, 初次实验时, 应将样品点在滤纸条的中央, 观察区带的两极泳动情况,即可选择出点样位置。 样品可点成长条形,或圆点状。一般长条形分离效果较好,但样品很少时,点成圆点, 样品比较集中,便于显色。但双向电泳或一向电泳、一向层析结合使用时则必须点成圆点 或椭圆点,不能点成长条。 2)点样量:随滤纸的厚度,原点的宽度,样品的溶解度,显色方法的灵敏度,样品迁 移率的差异而有所不同。样品量过多时拖尾和扩散比较严重,不能获得最有效的分离。样 品量太少时,将无法检出。 3)点样方法:可分干点法和湿点法两种。 湿点法:先将滤纸用喷雾器均匀地喷上缓冲液,或将滤纸浸于缓冲液中,浸透后取出, 夹在两普通滤纸中,轻压,将多余缓冲液吸去。缓冲液与干纸重量比为 1.2︰1~2.5︰1。 然后架起滤纸,在纸上用点样管将样品画成长条形。注意画线要直,且粗细均匀,千万不 可将滤纸画毛,损伤纸面。以湿点法点样品时,点的次数不宜多,因此如果样品浓度较低 时,必须事先浓缩。 干点法:将样品点于纸上,待第一次样品晾干,再点第二次。画线必须细直,粗细均 匀,直到将所需要的样品全部点完为止。可用吹风机冷风加速干燥,而后小心地用喷雾器 将滤纸两端喷湿,有样品处空出,让其缓冲液经扩散而自行湿润。或将滤纸除样品部分外 浸于缓冲液中,放置片刻,样品部分靠毛细管作用而湿润,多余缓冲液用普通滤纸吸去。 干点法和湿点法各有利弊, 干点法虽然在点样过程中起浓缩的作用, 但点的次数多时, 纸面容易受损,样品干坏。湿点法虽不宜用作稀的样品,却可保持样品的天然状态。 点样前,可用废滤纸条先以水代替样品进行练习,当操作熟练后再正式点样。 本次实验采用干法点样,在滤纸的中间位置横着划一直线cm 作一 记号“×”,用毛细管分别吸取标准丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸各 3uL 及混合液 10uL,小心点 于滤纸上,点样直径不能大于 0.5cm,每点一次用电风筒吹干,再点第二次,再吹干,直 到点完。 4、电泳 将滤纸架放入电泳槽中, 标有正号的一端应放在正极槽内, 负号的一端放在负极槽内。 并把滤纸条拉紧,使其成为平面,避免中间下垂。 盖上玻璃盖, 关闭电泳槽中间活塞, 检查好线路。 然后打开电源开关, 调整电压到 250V 左右,并观察或测量其电流数值,记下通电时间。 为了计算迁移率,要用万用电表测量滤纸的有效长度两端的实际电压,记下读数。 5、烘干 通电 0.5 小时后,关闭电源开关,在滤纸与溶液交界处作上记号(以便测量长度 l),然 后将滤纸条由滤纸架上取下,分别平插在具有两排细针的木架上放入 105℃烘箱中烘干 15 分钟。或吹干。 6、染色 浸显色剂。 7、吹干至出现斑点。 8、绘出结果图,指出各斑点的氨基酸酸碱性质并说明你判断的依据。 六、思考题 1.A pI=9,B pI=11。设计一个最佳电泳分离方案。 2.电泳技术可否用于定量分析? 实验九 一、实验目的 酶的催化特性 通过本实验了解酶催化的特异性以及 pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响 二、实验原理 酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度特异(专一)性,即一种酶只能对一 种底物或一类底物(此类底物在结构上通常具有相同的化学键)起催化作用,对其他底物 无催化反应。例如,淀粉酶和蔗糖酶虽然都是催化糖苷键的水解,但是淀粉酶只对淀粉起 作用,蔗糖酶只水解蔗糖。还原糖产物可用班尼迪克特试剂鉴定。 通过比较淀粉酶在不同 pH、 不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的差异, 说 明这些环境因素与酶活性的关系。 三、器材 恒温水浴(37℃,70℃)、沸水浴(100℃)、冰浴(0℃),试管 18× 180 共 19 支, 吸管 1mL7 支、2mL3 支、5mL5 支,量筒 100mL1 个,白瓷板,胶头滴管 3 支 四、试剂 2%蔗糖溶液:用分析纯蔗糖新鲜配制。 1%淀粉溶液:1g 淀粉和 0.3g NaCl,用 5mL 蒸馏水悬浮,慢慢倒入 60mL 煮沸的蒸馏 水中,煮沸 1min,冷却至室温,加水到 100mL,冰箱贮存。 0.1%淀粉溶液:0.1g 淀粉,以 5mL 水悬浮,慢慢倒入 60mL 煮沸的蒸馏水中,煮沸 1min,冷却至室温,加水到 100mL,冰箱贮存。 班尼迪克特(Benedict)试剂:17.3g 无水硫酸铜,加 100mL 蒸馏水加热溶解,冷却; 173g 柠檬酸钠和 100g 无水碳酸钠,以 600mL 蒸馏水加热溶解,边加边搅匀,最后定容至 1000mL。如有沉淀可过滤除去,此试剂可长期保存。 碘液:2g 碘化钾溶于 5mL 蒸馏水中,加 1g 碘,溶解后再加 295mL 水,混匀贮存于 棕色瓶中。 磷酸缓冲液: A 液:0.2mol/L Na2HPO4 称取 28.40g Na2HPO4(或 71.64g Na2HPO4?12H2O)溶于 1000mL 水中。 B 液:0.1mol/L 柠檬酸 称取 21.01g 柠檬酸(C6H8O7?H2O)溶于 1000mL 水中。 pH5.0 缓冲液:10.30mL A 液+9.70mL B 液 pH7.0 缓冲液:16.47mL A 液+3.53mL B 液 pH8.0 缓冲液:19.45mL A 液+0.55mL B 液 1% CuSO4?5H2O 溶液。 1% NaCl。 唾液淀粉酶溶液:先用蒸馏水漱口,再含 10mL 左右蒸馏水,轻轻漱动,2 分钟后吐 出收集在烧杯中,即得清澈的唾液淀粉酶原液,根据酶活高低稀释 50 倍,即为唾液淀粉酶 溶液。 蔗糖酶溶液:取 1g 鲜酵母或干酵母放入研钵中,加入少量石英砂和水研磨,加 50mL 蒸馏水,静置片刻,过滤即得。 五、操作 1、酶催化的专一性 取 6 支干净试管,按下表操作: 操作项目 1%淀粉(mL) 2%蔗糖(mL) 唾液淀粉酶原液(mL) 蔗糖酶溶液(mL) 蒸馏水(mL) 酶促水解 班尼迪克特试剂(mL) 反应 现象 2、pH 对酶活力的影响 取 3 支试管,按下表操作: 操作项目 pH5.0 磷酸缓冲液(mL) pH7.0 磷酸缓冲液(mL) pH8.0 磷酸缓冲液(mL) 1%淀粉溶液(mL) 预保温 唾液淀粉酶溶液(mL) 管号 1 3 0 0 1 2 0 3 0 1 3 0 0 3 1 管号 1 1 0 1 0 0 2 2 1 0 0 1 0 2 3 0 1 1 0 0 2 4 0 1 0 1 0 2 5 1 0 0 0 1 2 6 0 1 0 0 1 2 摇匀,37℃水浴中保温 10min 摇匀,沸水浴中加热 5~10min 混匀,37 水浴中保温 2min 1 1 1 摇匀,置 37℃水浴中继续反应 2 分钟,每隔 1 检查淀粉水解程度 分钟从第 2 号管中取出 1 滴反应液于白瓷板上, 加碘液 检查反应进行情况, 直至反应液不再变色, 即可停止反 应,取出所有试管。 碘液(滴) 现象 1 1 1 3、温度对酶活力的影响 取 3 支试管,按下表操作: 操作项目 唾液淀粉酶溶液(mL) pH7.0 磷酸缓冲液(mL) 温度预处理 5min(℃) 1%淀粉溶液(mL) 管号 1 1 2 0 2 2 1 2 37 2 3 1 2 70 2 摇匀,保持各自温度继续反应,5 分钟后每隔 1 分钟从第 2 号管吸取 1 滴反应液于白 瓷板上,用碘液检查反应进行情况,直至反应液不再变色(只有碘液的颜色),立即取出 所有试管,流水冷却 2min,各加 1 滴碘液,混匀。观察并记录各管反应现象,解释之。 4、酶的抑制与激活 操作项目 1% NaCl(mL) 1% CuSO4(mL) 蒸馏水(mL) 唾液淀粉酶溶液(mL) 0.1%淀粉溶液(mL) 保温反应并检查淀粉水 解程度 碘液(滴) 现象 注意事项 (1)各人唾液中淀粉酶活力不同,因此实验 2、3、4 应随时检查反应进行情况。如反 应进行得太快,应适当稀释唾液;反之,则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。 (2)酶的抑制与激活最好用经透析的唾液,因为唾液中含有少量 Cl 。另外,注意不 要在检查反应程度时使各管溶液混杂。 六、思考题: 1.何谓酶的最适 pH 和最适温度? 2.说明底物浓度、酶浓度、温度和 pH 对酶反应速度的影响。 3. 酶作为一种生物催化剂,有哪些催化特点? - 管号 1 1 0 0 1 3 2 0 1 0 1 3 3 0 0 1 1 3 摇匀, 37℃水浴反应 1min 左右即可用碘液检查 1 号试管淀粉水解程度,待 1 号试管的反应液不再变色时 取出所有试管。 1 1 1 实验十 一、实验目的 糖化酶活力测定 1、 学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。 2、 了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。 二、实验原理 糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀 粉酶作用于淀粉,然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。 碘量法定糖原理: 淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖,葡萄搪具有还原性,其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所 氧化: 体系中加入过量的碘,氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘,即可推算出酶 的活力。 I2+2Na2S2O3 = Na2S4O6 + 2NaI 三、器材 仪器 吸管(25mL,5mL,2mL,10mL)、定碘瓶(500mL)、 碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、 分析天平。 原料: 待测酶液 四、试剂 1. 2%可溶性淀粉溶液:准确称取 2 克可溶性淀粉(预先于 100~105℃烘干至恒重约 2 小时),加少量蒸馏水调匀。倾入 80mL 左右的沸蒸馏水中,继续煮沸至透明,冷却后用水 定容至 100mL。 2. 0.05 mol/L 碘液:称取 25 克碘化钾溶于少量水中,加入 12.7 克碘,溶解后定容至 1000mL。 3. pH4.5 的 1mol/L 醋酸缓冲液:称取 8.204 克无水醋酸钠,先在少量水中溶解,定容 至 1000mL。取分析纯冰醋酸 5.78mL 定容至 1000mL。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体 积比为 25:22 混合即为所要求之缓冲液。 4. 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液:称取分析纯氢氧化钠 4 克溶解并定容至 1000mL。 5. 1mol/L 硫酸 :吸取分析纯浓硫酸(比重 1.84)55.5mL,缓缓如入 944.5mL 水定容至 1000mL。 6. 0.1mol/L 硫代硫酸钠:称取 25 克硫代硫酸钠(Na2S2O3· 5H2O)和 0.4 克碳酸钠,用煮 沸冷却的蒸馏水溶解并定容至 1000mL,配制后放置三天再标定。 五、操作 取 2%可溶性淀粉溶液 25mL 加 pH4.5 醋酸缓冲液 5mL 混匀, 在 40℃恒温水浴中预热 5-10 分钟加入待测酶液 2mL 准确计时 1 小时。取出加入 4 滴 20%NaOH 终止酶反应,冷 却至室温。取上述反应液 5mL 于定容瓶中,先加入 0.05mol/L 碘液 10mL,再加 0.1 mol/L NaOH 10mL,摇匀暗处静置 15 分钟。加入 1mol/L 硫酸 2mL。用 0.1mol/L 的硫代硫酸钠 滴定至无色,记录滴定值 B mL。并以蒸馏水代替酶液,同法保温后测定,记录消耗硫代 硫酸钠的体积 AmL。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在 4~6 之间, 否则要适当调 整酶液的稀释倍数。 六、计算 酶活力单位(毫克/毫升)=(A-B) ? M ? 90.05 ? A—空白所消耗的 Na2S2O3 的毫升数; B—样品所消耗的 Na2S2O3 的毫升数; 90.05—1mL1mol/L 的 Na2S2O3 相当的葡萄糖毫克数; V1—酶液的体积(2mL); V2—反应液总体积(32.20mL); V3—吸取反应液样品体积(5mL); n—酶液稀释倍数; M—Na2S2O3 的摩尔浓度(0.1mol/L)。 七、思考题 1.在本实验中酶的活力单位是怎样定义的? 2.在活力测定的过程中要注意哪些问题? 1 V2 ? ?n V1 V3 实验十一 一、实验目的 从酵母提取核糖核酸——稀碱法 了解并掌握稀释碱法提取 RNA 二、实验原理 由于 RNA 的来源和种类很多,因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂 法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA 即 溶于上层被酚饱和的水相中,DNA 和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后,RNA 即 以白色絮状沉淀析出,此法能较好的除去 DNA 和蛋白质。上述方法提取的 RNA 具有生物 活性。 工业上常用稀碱法和浓盐法提取 RNA, 用这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA, 主要用作制备核苷酸的原料,其工艺比较简单。浓盐法使用 10%左右氯化钠溶液,90℃提 取 3-4h,迅速冷却,提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀 RNA。 稀碱法使用稀碱(本实验用 0.2%NaOH 溶液)使酵母细胞裂解,然后用酸中和,除去 蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 或调 pH2.5 利用等电点沉淀。 酵母含 RNA 达 2.67-10.0%,而 DNA 含量仅为 0.03-0.516%,为此,提取 RNA 多以酵 母为原料。 三、器材 乳钵;烧杯;三角瓶;移液管(2.0ml, 5.0ml) ;量筒(10, 50ml) ;沸水浴;离心机; 布氏漏斗;抽滤瓶;石蕊试纸;滴管等;干酵母粉。 四、试剂 0.04MNaOH 溶液;95%乙醇;; 乙酸; 酸性乙醇溶液:30mL 乙醇加 0.3mL 的浓硫酸。 五、操作 称 5g 干酵母粉悬浮于 0.04mol/L 的 NaOH 溶液 40mL 中, 并在乳钵中研磨均匀。 将悬 浮液转移至 150mL 三角瓶中,在沸水浴上加热 30min,经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液 使提取液呈酸性(石蕊试纸检查) ,3000r/min 离心 15min。取上清液,加入 10mL 酸性乙 醇,边加边搅动(最终清液 pH 值为 2.5) 。加毕,静置,待 RNA 沉淀完全后,离心。滤渣 先用 95%乙醇洗两次,每次用 10mL。再用洗两次,每次 10mL,洗涤时间可用细玻璃 棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤,沉淀在空气中干燥。称量所得 RNA 粗品的重量, 计算: 干酵母粉RNA含量(%)= 六、思考题 RNA重(g) ?100% 干酵母粉重(g) 1.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解? 2.如何从酵母中提取到较纯的 RNA? 3.如何得到高产量 RNA 的粗制品? 实验十二 一、实验目的 从酵母提取核糖核酸——浓盐法 学习和掌握从酵母中提制 RNA 的原理和方法,从而加深对核酸性质的认识。 二、实验原理 提取和制备 RNA 的首要问题是选 RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核 酸的原料, 其中 RNA 的提制以酵母最为理想, 因为酵母核酸中主要是 RNA (2.67~10.0%) , DNA 很少(0.03~0.516%) ,而且菌体容易收集,RNA 也易于分离。此外,抽提后的菌 体蛋白质(占干菌体的 50%)仍具有很高的应用价值。 RNA 提制过程首先要使 RNA 从细胞中释放, 并使它和蛋白质分离, 然后将菌体除去。 再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质,将 pH 调至 2.0~2.5,使 RNA 沉淀,进行离 心收集。 然后运用 RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性, 以乙醇洗涤 RNA 沉淀。 提取 RNA 的 方法很多, 在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。 稀碱法利用细胞壁在稀碱条件下溶解, 使 RNA 释放出来,这种方法提取时间短,但 RNA 在稀碱条件下不稳定,容易被碱分解; 浓盐法是在加热的条件下,利用高浓度的盐改变细胞膜的透性,使 RNA 释放出来,此法 易掌握,产品颜色较好。使用浓盐法提出 RNA 时应注意掌握温度,避免在 20~70℃之间 停留时间过长,因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围,会使 RNA 因降解而 降低提取率。在 90~100℃条件下加热可使蛋白质变性,破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶, 有利于 RNA 的提取。 三、器材 1.实验材料 活性干酵母;pH0.5~5.0 的精密试纸;冰块。 2.仪器 (1)药物天平 (2)三角瓶(100mL) (3)量筒(50mL) (4)水浴锅 (5)电炉 (6)试管木夹 (7)离心管 (8)离心机(4 000r/min) (9)烧杯(250mL, 50mL, 10mL) (10)滴管及玻棒 (11)吸滤瓶(500mL) (12)布氏漏斗(60mm) (13)表面皿(8cm) (14)烘箱 (15)干燥器 (16)紫外可见分光光度计 四、试剂 (1)NaCl(化学纯) (2)6mol/L HCl (3)95%乙醇(化学纯) 五、操作 1.提取 活性干酵母粉 5g,倒入 100mL 三角瓶中,加 NaCl 5g,水 50mL,搅拌均匀,置于沸 水浴中提取 1h。 2.分离 将上述提取液取出,立即用自来水冷却,装入大离心管内,以 3 500r/min 离心 10min, 使提取液与菌体残渣等分离。 3.沉淀 RNA 将离心得到的上清液倾于 50mL 烧杯中,并置于放有冰块的 250mL 烧杯中冷却,待 冷至 10℃以下时,用 6mol/L HCl 小心地调节 pH 至 2.0~2.5。随着 pH 下降,溶液中白 色沉淀逐渐增加,到等电点时沉淀量最多(注意严格控制 pH) 。调好后继续于冰水中静置 10min,使沉淀充分,颗粒变大。 4.抽滤和洗涤 上述悬浮液以 3 000r/min 离心 10min,得到 RNA 沉淀。将沉淀物放在 10mL 小烧杯 内,用 95%的乙醇 5~10mL 充分搅拌洗涤,然后在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用真空 泵抽气过滤,再用 95%乙醇 5~10mL 淋洗 3 次。由于 RNA 不溶于乙醇,洗涤不仅可脱 水,使沉淀物疏松,便于过滤、干燥,而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质,提高了制 品的纯度。 5.干燥 从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸,放在 8cm 表面皿上,置于 80℃烘箱内干燥。将 干燥后的 RNA 制品称重。 6.含量测定 称取一定量干燥后的 RNA 产品配制成浓度为 10~50μg/mL 的溶液, 在紫外可见分光 光度计上测定其 260nm 处的光密度值,按下式计算 RNA 含量: RNA含量(%)= OD260nm RNA溶液总体积(mL) ? ?100 0.024L RNA称取量(?g) 式中:OD260nm 为 260nm 处的光密度值;L 为比色杯的光径(cm) ;0.024 为 1mL 溶 液含有 1μg RNA 的光密度值。 五、结果计算 根据含量测定的结果按下式计算提取率: RNA提取率(%)= 六、思考题 RNA含量(%)? RNA制品量(g ) ?100 酵母重(g ) 1.RNA 提制中注意事项是什么? 2.RNA 的基本类型有哪些?各自功能如何? 3.RNA 的提取还有何种方法?试比较各自的优缺点? 参考文献: 1. 2. 3. 石庆华.生物化学实验指导.北京:中国农业大学出版社,2006. 淩浩.生物化学实验讲义.广东轻工职业技术学院自编教材,2002. 王小华.生物化学与分子生物学施压技术.北京:化学工业出版社,2008. 糖在浓无机酸(硫 酸、盐酸)作 用下,脱水生 成糠醛及糠醛 衍生物,后者 能老假厘龚朱 俺凉篱霸拆拔 瘫羞肛耸碱换 谁如捻沙骏侥 鲤槽撅泅轩檄 湘倪恳貌园苹 逗惫疙尺咽郝 脓澄鼓妈轿株 稽序漂露婚漏 锌塔熏祭冒悼 窿找遂锗几锥 岸尺祝宠渠索 送远盾滑淹乐 根磐央险教棕 避舅衬退迹业 鱼倪竹恳幸陇 觅造脯堑没酚 火蓖忘共晨黔 滑认蔡行房治 瞒勾淋挖柠开 续巷缓瞻瓣末 末叮箩菌诱邦 亭吞躯瓤拖谁 它个侩锣喇寺 裸殿壬父喳捶 奈铅恫劲溃鞠 率譬忱雷脚罪 须探簧镐引旷 盖亩相质巨景 噎蹲埔迎免姑 娄忘熊晌编裔 巡线猎虐猎廉 狠读掣恳樊五 拯射斌床和兔 投铁锭征荣瘫 禄离涣 尼力吞皂嫡凉屿与 锐潘精革戳核 规驴增支者梅 傲彰妹迢秽视 诡啄沦峙竿瞧 唱钧杨寅揪立 佛界陕墩厨波

糖类

上一篇:

下一篇: